makalah RT PCR AHMAD BINHUS

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  LATAR BELAKANG

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin pesat. Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia.

Secara umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Produk dari bioteknologi tradisional tersebut antara lain: tempe, oncom, yoghurt, dan keju.

Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya. Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning domba Dolly, antibodi monoklonal.

Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia (tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Real time Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan istilah RT. PCR.

1.2.  RUMUSAN MASALAH

Dari latar belakang tersebut, maka dapat dicari beberapa rumusan masalah yang dapat dibahas, antara lain:

1.      Apa yang dimaksud dengan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?

2.      Apa saja tahapan-tahapan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?

3.      Bagaimana metode dan interprestasi hasil Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?

1.3   TUJUAN PENULISAN

1.      mengetahui pengertian dari Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

2.      mengetahui tahapan-tahapan dari Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR

4.      mengetahui metode dan interprestasi hasil Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

BAB II

PEMBAHASAN

2.1  Definisi Real-Time PCR (qPCR)

Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda).

Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

gambar alat Real time polymerase chain reaction ( RT-PCR)

2.2  PRINSIP DAN METODE

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.

 Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes). Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :

(1)   Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green.

(2)   Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.  

RT-PCR dapat dibedakan menjadi dua metode yaitu one-step RT-PCR dan two-steps RT PCR. One step RT-PCR merupakan metode yang lebih umum dilakukan karena reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan dalam satu langkah. Akan tetapi pada two-steps RRT-PCR, reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan secara terpisah.

Two-step RRT-PCR juga menggunakan primer yang berbeda pada masing-masing reaksi. Umumnya primer yang digunakan pada reaksi RT adalah oligo-dT kemudian dilanjutkan menggunakan primer Urutan Nukleotida Spesifik pada reaksi siklus PCR. Sedangkan One-step RRT-PCR hanya memerlukan satu primer yang spesifik terhadap kedua reaksi tersebut (Qiagen, 2007).

RT-PCR yang dilakukan dengan metode One step dapat menurunkan resiko terjadinya kontaminasi silang dan waktu yang dibutuhkan lebih cepat dibandingkan dengan two-steps RRT-PCR. Meskipun demikian One step RRT-PCR kurang sensitif jika dibandingkan dengan two-step RRT-PCR (Trani, 2005).

2.3  PROSEDUR KERJA DAN INTEPRESTASI

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti amplifikasi logaritmik.

RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik dimana RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan.

Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA at 95°C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu anealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation.

Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler.

gambar prosedur kerja RT-PCR

interpretasi  hasil

contoh interpretasi hasil pada alat rt-PCR

a.       Limit deteksi untuk Influenza Tipe A (Matrix gene-specific TaqMan assay) :

·         Ct < 33 = positif

·         Ct 33 – 38 ambiguous, perlu diulang atau diteliti lebih lanjut

·         Ct > 38 = negatif

b.      Limit deteksi untuk subtipe H5 (Matrix gene-specific TaqMan assay) :

·         Ct < 36 = positif

·         Ct 36 – 40 ambiguous, perlu diulang atau diteliti lebih lanjut

·         Ct > 40 = negatif

BAB III

PENUTUP

3.1  KESIMPULAN

Dari hasil pembahasan kami dapatkan mensimpulkan perbedaan dari PCR dan RT PCR dimana perbedaannya adalah Reverse Transcription PCR dilakukan untuk menggandakan untaian RNA setelah diubah menjadi cDNA (dengan Enzim reverse transcriptase) lalu diperbanyak dengan PCR. sedangkan pada Real Time PCR (qPCR) merupakan kegiatan yang melibatkan RT-PCR yang diteruskan dengan perhitungan jumlah cDNA yang ada. Singkatnya, perbedaan terletak pada seberapa pentingnya kuantifikasi DNA.

3.2  SARAN

1.      penyusun menyarankan  setiap prosedur kerja harus  dipatuhi sehingga tidak menimbulkan kesalahan dalam pemeriksaan.

2.      Makalah ini masih jauh dari sempurna maka dari itu penyusun mengharapkan agar pembaca mencari literatur atau referensi yang banyak dalam penyusunan isi dari materi makalah ini.